“但如果我们不做,“杨平看着他,“M7可能会在恢复运动功能的同时,承受慢性疼痛的折磨。你愿意看到它一边走路,一边痛得发抖吗?没有在分子层面提出有效解决方法之前,这是最好的方法。“
唐顺张了张嘴,没有说话。
韦伯打破了沉默:“杨教授,你的方案在理论上是成立的。但光遗传学在灵长类脊髓中的应用,还没有先例。我们需要做大量的预实验,验证病毒载体的靶向性、光刺激的深度、和长期安全性。“
“我知道,“杨平说,“所以我们分两步走。第一步,体外验证,在M7的脊髓切片上,测试病毒载体的转染效率和光刺激的效果。第二步,如果体外成功,再在M7身上做体内实验。“
“时间上呢?“伊娃问,“按照你的时间线,我们最多还有两到三周的时间窗。“
“体外验证需要一周,“杨平算了算,“如果成功,体内实验需要两到三天准备,一周内可以完成植入。刚好赶上。“
“如果失败呢?“曼因斯坦问。
杨平沉默了几秒钟,然后说:“那就用备选方案,鞘内注射巴氯芬,一种GABA_B受体激动剂。效果不如光遗传学精准,但可以全身性增强抑制性调控。副作用是肌张力降低,可能影响运动恢复。“
“所以光遗传学是A方案,巴氯芬是B方案,“韦伯总结,“我同意这个计划。但有一个条件,体外验证必须由我亲自来做,光遗传学是我的老本行,我在海德堡的时候做过类似的实验。“
“好,“杨平点头,“韦伯教授负责体外验证,伊娃负责闭环传感器升级,莉娜负责数据分析模型,汉斯负责病毒载体和光纤制备。唐顺,你协调所有资源,确保一周内出结果。“
“明白!“
体外验证开始。
韦伯亲自主刀,从M7的脊髓损伤区取了一小块组织,大约两立方毫米,放在冰冷的人工脑脊液中,切成了三百微米厚的薄片。这些薄片被转移到培养皿中,保持存活状态,可以持续记录电生理活动四到六个小时。
病毒载体是AAV9-hSyn-NpHR-EYFP,一种经过改造的腺相关病毒。AAV9对神经元有高度的嗜性,hSyn启动子确保NpHR只在神经元中表达,EYFP作为荧光标记,方便在显微镜下观察转染效率。
韦伯把病毒溶液滴在脊髓切片上,孵育两个小时。然后用PBS冲洗三遍,放在共聚焦显微镜下观察。
“转染效率,“他调整着焦距,“大约百分之三十五。“
“百分之三十五,“曼因斯坦在旁边记录,“够吗?“
“理论上,脊髓背角的抑制性中间神经元占总神经元数量的百分之二十到三十。百分之三十五的转染效率,意味着大部分抑制性神经元都能被靶向,足够了。“
下一步是电生理验证,韦伯把一片转染过的脊髓切片放到电生理记录槽中,用玻璃微电极记录背角神经元的自发放电。同时,他在切片的上方放置了一根直径两百微米的光纤,连接到一台黄色激光器上。
“基线放电频率,“他看着示波器,“每秒五赫兹,正常范围。“
然后他打开了激光器。一束微弱的黄光透过光纤,照射在脊髓切片的表面。
“光强,一毫瓦每平方毫米,波长,五百九十纳米。“
示波器上的波形变了,自发放电频率从每秒五赫兹降到了每秒一赫兹,降幅百分之八十。
“抑制效果确认,“韦伯的声音很平静,但曼因斯坦注意到他的手微微颤抖,“NpHR被激活后,氯离子内流,神经元超极化,放电减少。“
“可逆吗?“杨平问。
韦伯关掉激光器,十秒钟后,放电频率恢复到每秒四点八赫兹。
“完全可逆。“
会议室里爆发出一阵压抑的欢呼。唐顺和汉斯击了一下掌,莉娜在笔记本上飞快地敲着字,伊娃难得地露出了一丝微笑。
但韦伯没有笑,他盯着那片脊髓切片,看了很久,然后说:“这只是体外,体内的环境复杂得多,炎症、免疫反应、胶质瘢痕、血流变化。体外成功,不代表体内能成功。“
“我知道,“杨平说,“但我们至少证明了,这个方向是对的,科研就是摸着石头过河。“
“摸着石头过河?”
韦伯捉摸着这句话,他赞叹:
“这是富有哲理的一句话。”
紧接着,体内实验也开始进行。
这一次,手术的规模比前两次都大。杨平主刀,曼因斯坦协助,伊娃负责电生理监测,汉斯负责病毒注射和光纤植入,韦伯在台下观摩。
手术的第一步,是病毒注射。汉斯用一根玻璃微注射针,把五微升AAV9-hSyn-NpHR-EYFP溶液缓慢地注入M7的脊髓背角,双侧,每个注射点一微升,共十个注射点。注射的速度极慢,每分钟零点一微升,以避免压力损伤。
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